糖蛋白在人体蛋白质中占比超过50%，并且是绝大多数生物制药的关键成分。作为最广泛且复杂的翻译后修饰（PTM）之一，蛋白质的糖基化在调控众多生物过程方面发挥着重要作用。对糖蛋白的一级序列进行深入分析，特别是糖基化位点的识别及相关聚糖结构的研究，成为了解糖蛋白功能的关键所在。

液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）已成为鉴定蛋白质及发现其翻译后修饰的重要工具。与传统的数据库搜索策略不同，从头测序是一种全新的方法，它不依赖于事先已知的DNA或氨基酸序列。然而，糖基化位点的复杂性可能导致序列覆盖不全和游离寡糖修饰谱的不明确，这使得获取包含丰富信息的糖肽碎裂谱以支持从头测序成为一项挑战。普遍存在的糖基化常导致某些区域出现信息空白，从而限制了从头测序在具有一致结构和已知N-link糖基化位点的单克隆抗体（mAb）中的应用。

在2025年发表的研究中，提到了一种基于质谱的未知糖蛋白解码的新方法。这种方法结合了糖基释放介导的从头测序与糖基化位点的表征，利用N-/O-糖的去糖基化以实现更为全面的序列覆盖，同时结合EThcD碎裂技术，便于识别高质量的长肽，从而进一步促进精确的蛋白质拼接。同时，该研究还将该方法应用于复杂糖基化融合蛋白依那西普（Enbrel）及三种新型肿瘤坏死因子受体：Fc融合生物制剂的从头测序，揭示了它们在一级序列上的细微差异。

在分析过程中，研究团队应用了N-糖苷酶F（PNGaseF）去除N-聚糖，内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，并结合唾液酸酶确保去糖基化的效果。随后，通过完整质量分析确认去糖基化的成功与否，并利用电子转移高能碰撞解离（EThcD）技术获取高质量肽段，最终采用PEAKS AB对其序列进行分析。

研究者进一步采用18O标记的PNGaseF酶解，将糖基化的Asn转化为Asp并进行定量分析，以识别糖基化位点。此外，样本使用内切糖苷酶混合物（如Endo CC、Endo S和Endo H）处理，以分析带有“GlcNAc”或“GlcNAc-Fuc”修饰的产物，验证N-糖基化位点的鉴定结果。

基于该新策略，研究团队成功揭示了依那西普及新型TNFR: Fc融合生物制剂的结构特点及糖基化修饰。该策略有效填补了从头测序与糖基化修饰之间的空缺，不仅提供有关糖蛋白一级结构的重要信息，还为生物医药领域中的应用奠定了坚实基础。

总之，基于质谱的蛋白质从头测序为揭示氨基酸序列提供了一种有力的工具，结合糖苷酶酶解及EThcD碎裂技术，显著提升了蛋白质测序的准确性与糖基化表征。这一创新方法为深入理解高度糖基化的蛋白质，尤其是在生物药物如尊龙凯时系列中，提供了新的研究方向，促进了相关疾病的治疗。